繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量 Marker 的各條帶的已知分子量為縱坐標(biāo),以條帶遷移距離(從加樣孔中心到條帶中心的距離)為橫坐標(biāo),在坐標(biāo)系中描點。使用專業(yè)繪圖軟件(如 GraphPad Prism、Origin)進行線性回歸分析,繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。通常情況下,在一定分子量范圍內(nèi),蛋白質(zhì)的遷移距離與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。
計算樣品分子量:測量樣品條帶的遷移距離,將其代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中,計算出樣品蛋白質(zhì)的分子量。在計算過程中,要確保測量的準(zhǔn)確性,多次測量取平均值以減少誤差。若樣品條帶遷移距離超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍,則需要重新選擇合適分子量范圍的 Marker,或調(diào)整實驗條件(如凝膠濃度)重新電泳。
灰度值測定:利用凝膠成像分析軟件(如 ImageJ、Quantity One)對凝膠圖像進行處理,測定各蛋白質(zhì)條帶的灰度值。灰度值與蛋白質(zhì)的含量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān),但不同軟件的測定原理和算法可能存在差異,因此在分析數(shù)據(jù)時,需使用同一軟件且保持參數(shù)設(shè)置一致。
相對表達量計算:以內(nèi)參蛋白(如 β- 肌動蛋白、甘油醛 - 3 - 磷酸脫氫酶等)的條帶灰度值作為參照,計算目標(biāo)蛋白的相對表達量。公式為:目標(biāo)蛋白相對表達量 = (目標(biāo)蛋白灰度值 / 內(nèi)參蛋白灰度值)× 100% 。通過比較不同樣品中目標(biāo)蛋白的相對表達量,可分析蛋白質(zhì)在不同條件下(如不同組織、不同處理組)的表達差異。
條帶數(shù)量與強度分析:觀察凝膠上蛋白質(zhì)條帶的數(shù)量和強度,若只有單一清晰條帶,說明蛋白質(zhì)純度較高;若存在多條雜帶,則表明樣品中含有雜質(zhì)蛋白。通過計算目標(biāo)蛋白條帶灰度值占所有條帶總灰度值的比例,可大致估算蛋白質(zhì)的純度。例如,目標(biāo)蛋白條帶灰度值占總灰度值的 90% 以上,可認(rèn)為該蛋白質(zhì)純度較高。
與標(biāo)準(zhǔn)樣品對比:將樣品與已知純度的標(biāo)準(zhǔn)樣品在同一凝膠上進行電泳,對比兩者的條帶情況。若樣品條帶與標(biāo)準(zhǔn)樣品條帶一致,且無明顯雜帶,進一步驗證了樣品的純度;若存在差異,則需分析差異產(chǎn)生的原因,判斷是否為雜質(zhì)或其他因素導(dǎo)致。
條帶位置與數(shù)量變化:對比正常樣品和處理后樣品的電泳條帶,若出現(xiàn)新的條帶且位置不同于已知蛋白質(zhì)條帶,可能是蛋白質(zhì)發(fā)生了修飾(如磷酸化、糖基化等)或降解產(chǎn)生了新的片段。通過分析新條帶的分子量和遷移特性,結(jié)合相關(guān)文獻和實驗背景,推測蛋白質(zhì)修飾或降解的類型和位點。
條帶強度變化:某些蛋白質(zhì)修飾或降解過程可能會影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和表達量,導(dǎo)致條帶強度發(fā)生變化。例如,蛋白質(zhì)磷酸化可能會增強其穩(wěn)定性,使條帶強度增加;而蛋白質(zhì)降解則會使條帶強度減弱。通過對條帶強度變化的分析,可進一步研究蛋白質(zhì)修飾或降解對其功能的影響。